熒光樣本制作所需材料

(一)載玻片

載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片要光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標(biāo)本。

(三)標(biāo)本

組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油，要無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，要使用鏡油，請使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。

熒光標(biāo)本的制作方法：

樣品須經(jīng)過石蠟包埋切片，然后用鐵礬蘇木精染色，普通光鏡觀察效果還可以作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色，

石蠟切片的過程：

1. 取材：刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜. 取材時(shí)間越快越好.

2. 固定: 組織取下后應(yīng)立即放入10%福爾馬林(相當(dāng)于4%甲醛)固定.

注意：(1). 固定液量應(yīng)為組織塊體積的40倍.

(2) 固定時(shí)間：固定時(shí)間與使用的固定液種類和組織塊大小, 溫度等有關(guān). 一般為3h-24h.

(3)固定溫度：大多可在室溫固定, 在低溫(4℃)時(shí)間應(yīng)延長.

(4)固定容器：固定容器應(yīng)大些.

3. 漂洗：流水沖洗2—10h.

4. 脫水: 從低濃度酒精到高濃度酒精.

70%(數(shù)分鐘)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→****(60-120’)→****(60-120’).

5. 透明: 組織塊脫水后要經(jīng)過一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑, 而使石蠟進(jìn)入組織塊. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.

6. 浸蠟: 組織經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟. 一般需經(jīng)2—3次浸漬才能完成, 總時(shí)間為3—4h. 用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為52—56℃.

7. 包埋: 先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入. 包埋面要平整. 包埋后石蠟稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8. 切片：修塊→切片→展片→撈片→烤片.也可作冰凍切片.

熒光染料的配制：

儲藏液：1mg/ml dapi(DMSO、去離子水、pbs都可以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色時(shí)須避光，10min左右

用pbs沖去多余染液即可觀察